En esencia, la preparación de muestras abarca todos los pasos realizados para transformar una muestra cruda en una forma refinada adecuada para el análisis mediante un instrumento. Estos métodos van desde la simple filtración y dilución hasta complejos procedimientos de extracción y concentración de varios pasos diseñados para aislar compuestos específicos. El objetivo final es eliminar las interferencias y presentar el analito objetivo al instrumento de una manera que garantice una medición precisa y fiable.
El instrumento analítico más sofisticado del mundo no puede producir buenos datos a partir de una muestra mal preparada. La preparación de muestras no es una tarea preliminar; es el paso más crítico del proceso analítico, ya que rige directamente la calidad, precisión y fiabilidad de sus resultados finales.
Los objetivos fundamentales de la preparación de muestras
Antes de elegir una técnica específica, es fundamental comprender por qué es necesaria la preparación de muestras. Cada método está diseñado para lograr uno o más de cuatro objetivos fundamentales.
Aislamiento del analito de interés
Su compuesto objetivo, o analito, es a menudo solo un componente dentro de una mezcla compleja. El objetivo principal es separar este analito de todo lo demás en la matriz de la muestra original, como proteínas, lípidos, sales o pigmentos.
Eliminación de sustancias interferentes
Una matriz de muestra contiene muchos componentes que pueden interferir con su análisis. Estas interferencias pueden suprimir la señal del instrumento, crear señales falsas positivas o incluso dañar componentes sensibles del instrumento, como una columna analítica. Un buen método de preparación elimina estas sustancias.
Concentración del analito
En muchos casos, el analito está presente en una concentración demasiado baja para que el instrumento lo detecte de forma fiable. Se utilizan técnicas de preparación como la extracción en fase sólida o la evaporación del disolvente para aumentar la concentración del analito a un nivel medible.
Garantizar la compatibilidad del instrumento
La muestra preparada final debe estar en un disolvente o estado que sea compatible con el instrumento analítico. Por ejemplo, una muestra para cromatografía de gases (GC) debe ser volátil, y una muestra para cromatografía líquida (LC) debe estar completamente disuelta en un disolvente compatible con la fase móvil.
Un panorama de las técnicas comunes
Los laboratorios utilizan una amplia gama de técnicas, a menudo en combinación, para lograr los objetivos descritos anteriormente. La elección depende del tipo de muestra, el analito objetivo y el instrumento analítico.
Extracción en Fase Sólida (SPE)
La SPE es una técnica muy versátil y ampliamente utilizada para la limpieza y concentración de muestras. Funciona pasando una muestra líquida a través de un cartucho empaquetado (un sorbente) que retiene selectivamente el analito o las interferencias, permitiendo su separación. Es un pilar en los laboratorios medioambientales, clínicos y farmacéuticos.
Extracción Líquido-Líquido (LLE)
La LLE es un método clásico que separa compuestos basándose en sus solubilidades diferenciales en dos líquidos inmiscibles, normalmente agua y un disolvente orgánico. La muestra se mezcla con los dos disolventes y el analito se reparte en el disolvente en el que es más soluble, dejando atrás las interferencias.
Filtración
La filtración es un proceso de separación física fundamental utilizado para eliminar partículas sólidas de un líquido o gas. En un entorno de laboratorio, esto se realiza habitualmente con filtros de jeringa para proteger de la obstrucción a instrumentos sensibles como un HPLC.
Centrifugación
Esta técnica utiliza la fuerza centrífuga para separar los componentes de una mezcla basándose en su tamaño, densidad y forma. Se utiliza comúnmente para sedimentar células, precipitar ADN o separar líquidos inmiscibles después de un paso de extracción.
Homogeneización y Lisis
Cuando el analito se encuentra dentro de células o tejidos, el primer paso es romperlos. La homogeneización implica la alteración mecánica del tejido, mientras que la lisis se refiere a la descomposición de la membrana celular, a menudo mediante detergentes químicos o métodos físicos como la sonicación (ondas sonoras de alta frecuencia).
Derivatización
A veces, un analito no es adecuado para un análisis concreto (por ejemplo, no es lo suficientemente volátil para GC). La derivatización es una reacción química que modifica el analito para dotarlo de propiedades más favorables, como una mayor volatilidad o una estructura que se detecte más fácilmente.
Comprensión de las compensaciones
Ningún método es perfecto para todas las situaciones. Elegir el adecuado implica equilibrar varios factores clave.
Velocidad frente a selectividad
Los métodos altamente selectivos como la SPE de varios pasos proporcionan una muestra excepcionalmente limpia, pero pueden consumir mucho tiempo y ser complejos. En contraste, un enfoque simple de "diluir y analizar" (dilute-and-shoot) es muy rápido, pero solo funciona para muestras relativamente limpias donde las interferencias y la concentración no son las principales preocupaciones.
Coste y complejidad
La filtración simple es económica y requiere una formación mínima. Por el contrario, los sistemas SPE automatizados representan una importante inversión de capital y requieren más experiencia para desarrollar y validar métodos, aunque ofrecen un rendimiento y una reproducibilidad mucho mayores.
Volumen de muestra y concentración del analito
La cantidad de muestra que tiene y la concentración esperada de su analito son factores críticos. Técnicas como la Microextracción en Fase Sólida (SPME) son excelentes para el análisis a nivel de trazas a partir de pequeños volúmenes, mientras que la LLE suele ser más adecuada para extracciones a granel a partir de volúmenes de muestra mayores.
El riesgo de pérdida de analito
Cada paso de manipulación —desde la transferencia de un líquido hasta la evaporación de un disolvente— introduce el riesgo de perder parte de su analito objetivo. Los procedimientos más complejos con más pasos tienen un mayor potencial de pérdida de analito, lo que puede afectar negativamente a la precisión y exactitud de su cuantificación final.
Selección del método adecuado para su análisis
Su elección de preparación de muestras debe guiarse directamente por la matriz de su muestra y su objetivo analítico.
- Si su enfoque principal es el análisis de matrices complejas (sangre, suelo, alimentos): Necesita un método con potentes capacidades de limpieza, lo que convierte a la Extracción en Fase Sólida (SPE) en un excelente punto de partida.
- Si su enfoque principal es la detección de concentraciones muy bajas: Dé prioridad a una técnica que incluya un paso de concentración, como la SPE o la evaporación del disolvente tras una extracción.
- Si su enfoque principal es la velocidad con una muestra relativamente limpia: Una simple filtración seguida de una inyección directa o un protocolo de "diluir y analizar" puede ser suficiente.
- Si su enfoque principal es el análisis de compuestos no volátiles mediante Cromatografía de Gases: Debe investigar la derivatización química para hacer que su analito sea adecuado para el instrumento.
Dominar la preparación de muestras es el primer y más crítico paso para generar datos en los que pueda confiar.
Tabla de resumen:
| Método | Objetivo principal | Aplicaciones comunes |
|---|---|---|
| Extracción en Fase Sólida (SPE) | Limpieza y concentración | Medioambiental, Farmacéutica, Clínica |
| Extracción Líquido-Líquido (LLE) | Separación por solubilidad | Extracciones de muestras a granel |
| Filtración | Eliminar partículas | Protección de HPLC, Clarificación general |
| Centrifugación | Separar por densidad | Sedimentar células, Separar líquidos |
| Homogeneización/Lisis | Liberar analitos celulares | Análisis de tejidos y células |
| Derivatización | Modificar para idoneidad del instrumento | Análisis GC de no volátiles |
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